月桂冠トップ > 月桂冠総合研究所 > バイオの研究 > 醸造のコクと旨みの秘密にせまる!
月桂冠総合研究所
研究所トップ
  • 概要
  • 研究所長
  • 歴史
  • 研究試薬
  • 発表
  • 論文
  • 受賞

髪に優しいメラニン白髪染め。原料の発酵生産に成功


プロテアーゼは、タンパク質を分解してコクと旨みのもととなるアミノ酸やペプチドをつくる働きがあります。日本の伝統醸造食品である日本酒、醤油、味噌などのコクと旨みは、このプロテアーゼの働きが強く関与しています。これら醸造に使われる「麹菌」のプロテアーゼを「麹菌」を使って高生産することに成功しました。

<研究キーワード:麹菌(Aspergillus oryzae)、プロテアーゼ(protease/peptidase)、セルフクローニング(self-cloning)、高生産>

研究テーマ 麹菌プロテアーゼのセルフクローニングによる高生産

【研究目的】

麹菌(Aspergillus oryzae)は、清酒、醤油、味噌など、日本の伝統的な醸造食品の製造に不可欠な微生物です。これらの醸造食品において、米・大豆のタンパク質が麹菌のプロテアーゼにより分解されることにより、コクと旨みに寄与するアミノ酸とペプチドが生成されます。2005年に麹菌ゲノム解析が終了し、麹菌ゲノムには推定134種類のプロテアーゼをコードする遺伝子が存在することが示されました。これらのプロテアーゼの中には、タンパク質を分解して、例えば、血圧を降下させる活性を有する機能性ペプチドの生産を可能とするものがあることが推察されます。

そこで本研究では、麹菌の相同組換えによるタンパク質遺伝子発現系を構築し、得られた麹菌(セルフクローニング株)を用いてプロテアーゼを高生産させることを目的としました。 その結果、ロイシン要求性相補マーカー遺伝子であるleuAを利用した、セルフクローニングでのタンパク質遺伝子発現系が構築でき、合計20種類の麹菌プロテアーゼ遺伝子についてセルフクローニング株を得ることができ、それらの株を用いてプロテアーゼの高生産を行うことに成功しました。

なお本研究は、独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構・生物系特定産業技術研究支援センターの平成18年度採択「新技術・新分野創出のための基礎研究推進事業」(研究課題名:ゲノム情報に基づく麹菌全プロテアーゼの機能解析、研究代表者:東京農工大学大学院農学研究院 教授 竹内道雄先生)として行われたものです。

【麹菌セルフクローニング発現系の開発】

セルフクローニング株の構築において、導入する遺伝子が麹菌宿主のゲノム中の特定の座位に相同組換えすることが望ましいといわれております。しかし、麹菌では、一般に相同組換えと非相同組換えが起こり、その制御は重要な課題でした。

セルフクローニング株構築の予備試験として、選択マーカーをA. oryzae由来ロイシン要求性相補マーカーleuAとし、まずleuAのみを麹菌ロイシン要求性変異株(leuA-)に形質転換しました。その結果、得られた形質転換株10株中5株において、相同組換えが起こっていることが明らかとなりました(図1)

 

図1 leuAマーカーのみを導入した形質転換体のゲノムサザン解析

この結果から、選択マーカーをleuAとすることで、ligD欠損変異株などの特殊な宿主を用いることなく、セルフクローニングで遺伝子発現カセットを染色体上のleuA座位に導入可能なことが示されました。そこで、遺伝子発現カセットを、leuAマーカーの中間へ挿入したDNA断片を麹菌ロイシン要求性変異株へ導入しました(図2)。得られた形質転換株における発現カセットの挿入領域をサザン解析により確認したところ、形質転換株10株のうち7株において、相同組換えが起こりました(図3)。これは、上述したleuAマーカーのみの導入における相同組換え効率と同等の頻度でした。この結果から、選択マーカーをleuAとした発現カセットを用いることで、容易にセルフクローニング株を得られることが明らかとなり、セルフクローニングによる遺伝子発現系の構築に成功しました。

図2 麹菌相同組換え技術の開発(モデル図)

図3 leuAを用いた新規セルフクローニング相同組み換え技術

【麹菌プロテアーゼのセルフクローニングによる高生産】

上記のロイシン要求性相補マーカーleuAを用いた麹菌セルフクローニング発現系を用いて、麹菌プロテアーゼのセルフクローニングによる高生産の検討を行いました。

まず、麹菌プロテアーゼpepE(DDBJ no. AB074195)について発現を試みました。プロモーターとしては、麹菌のsodMプロモーターを用いて、ロイシン要求性変異株を宿主としてセルフクローニング株の構築を行いました。得られたセルフクローニング株は、液体培養条件において、菌体外へ数g/L-brothレベルでpepEプロテアーゼを生産しました(図4)

図4 麹菌pepEプロテアーゼの高生産

また、pepE以外の麹菌プロテアーゼ遺伝子についても発現も検討しました。具体的には、下記1.と2.を中心に検討しました。

  1. sodMプロモーターのみならずhly、glaA、amyAおよびpdiAプロモーターも検討
  2. 培養条件として液体培養培養にみならず固体培養も検討

1.と2.を組み合わせた結果、アルカリプロテアーゼ(DDBJ no. X54726)、中性プロテアーゼI(DDBJ no. AF099904)、酸性プロテアーゼpepA(DDBJ no. D13894)、中性プロテアーゼ2種類、デューテロリシン、カルボキシペプチダーゼ4種類、ジペプチジルアミノペプチダーゼ、ジペプチジルペプチダーゼ、オリゴペプチダーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ、アミノペプチダーゼI、プロリルアミノペプチダーゼ、aspartyl protease 2種類およびAorsin(DDBJ no. AB084899)の合計19種類のプロテアーゼについて、セルフクローニングによる高生産に成功しました。

まとめ

本研究では、ロイシン要求性相補マーカーleuAを利用した、麹菌セルフクローニング発現系を構築でき、得られたセルフクローニング株を用いて合計20種類の麹菌プロテアーゼについて高生産に成功しました。また、本成果を用いれば、特定のプロテアーゼの高生産のみならず、そのプロテアーゼを用いた機能性ペプチド、例えば血圧降下ペプチド(「酒『粕』も百薬の長 酒粕から血圧を下げるペプチド」を参照)などをより効率的に生産することが可能となります。

【参考文献】

  1. Isolation of a novel promoter for efficient protein production in Aspergillus oryzae.
    Ishida H, Hata Y, Kawato A, Abe Y, Kashiwagi Y
    Biosci Biotechnol Biochem., 68:1849-1857(2004)
  2. Isolation of a novel promoter for efficient protein expression by Aspergillus oryzae in solid-state culture.
    Bando H, Hisada H, Ishida H, Hata Y, Katakura Y, Kondo A
    Appl Microbiol Biotechnol., 92:561-569(2011)

【学会発表】

    ◆麹菌ポストゲノム解析を支援するAspergillus nidulans発現用プラスミドの構築
    第7回糸状菌分子生物学カンファレンス(2007)
    ○石田 博樹、秦 洋二、楠本 憲一、山形 洋平、小出 芳直、竹内 道雄
    ◆麹菌(A. oryzae)のセルフクローニングによる物質生産(1)麹菌アルカリプロテアーゼの高生産
    日本農芸化学会大会(2008)
    ○石田 博樹、秦 洋二、楠本 憲一、山形 洋平、小出 芳直、竹内 道雄
    ◆麹菌(A. oryzae)のセルフクローニングによるプロテアーゼ生産
    第8回糸状菌分子生物学コンファレンス(2008)
    ○石田 博樹、秦 洋二、楠本 憲一、山形 洋平、小出 芳直、竹内 道雄
    ◆麹菌(A. oryzae)のセルフクローニングによるプロテアーゼ生産(2)~発現プロモーターの選択~
    農芸化学会大会(2009)
    ○石田 博樹、秦 洋二、楠本 憲一、山形 洋平、小出 芳直、竹内 道雄
    ◆麹菌Aspergillus oryzae由来プロテアーゼの麹菌での大量生産
    日本生物工学会大会(2010)
    ○坂東 弘樹、石田 博樹、秦 洋二、楠本 憲一、山形 洋平、天野 仁、竹内 道雄
    ◆麹菌Aspergillus oryzae由来プロテアーゼの麹菌での大量生産
    第10回糸状菌分子生物学コンファレンス(2010)
    ○坂東 弘樹、石田 博樹、秦 洋二、楠本 憲一、山形 洋平、天野 仁、竹内 道雄
    ◆麹菌Aspergillus oryzae由来プロテアーゼによる機能性ペプチド生産
    農芸化学会大会(2011)
    ○坂東 弘樹、石田 博樹、秦 洋二、楠本 憲一、山形 洋平、天野 仁、竹内 道雄

【シンポジウム】

    ◆麹菌のセルフクローニングによるプロテアーゼの高生産
    生研センター「新技術・新分野創出のための基礎研究推進事業」合同成果発表会、麹菌ゲノム科学の産業への利用(2009)
    ○石田 博樹
    ◆麹菌プロテアーゼのセルフクローニングによる高発現、酵素剤化及び機能性ペプチド生産への応用
    日本食品科学工学会、生研センター「新技術・新分野創出のための基礎研究推進事業」(2010)
    ○石田 博樹、坂東 弘樹、秦 洋二

【特許】

      ◆特開2010-004760:糸状菌プロテアーゼの生産方法
      石田 博樹、秦 洋二、山形 洋平、小出 芳直、竹内 道雄
      ◆特開2012-065552:糸状菌ペプチダーゼの生産方法
      坂東 弘樹、石田 博樹、秦 洋二

(掲載日:2013年7月3日)

バイオの研究 バイオの研究 お酒の研究 美と健康の研究
ページのトップへ