麹菌を用いたPET（難分解性プラスチック）分解酵素の生産
-奈良先端大との共同研究、お酒造りで培った技術で環境問題を解決する-
研究背景
ペットボトルに使われるPET（樹脂）は、原料であるエチレングリコールとテレフタル酸から合成され、これらが無数に重合したもので、その強固さから衣服の原料としても利用されていますが、自然界においては非常に分解されにくいプラスチック（難分解性プラスチック）として知られています。これまでPETを分解することができる微生物Ideonella sakaiensis（イデオネラ・サカイネシス）が自然界から分離され、PETaseとMHETaseの2つの酵素でPETを原料まで分解できることが明らかにされてきましたA)。しかしながら、PETaseとMHETaseの大量生産については検討がなされていなかったことから、奈良先端科学技術大・吉田昭介教授らの研究グループと共同で取り組むこととしました。
Ideonella sakaiensisのPET分解酵素の麹菌での生産検討
お酒造りで用いられる麹菌はタンパク質生産力が高いことから、麹菌を宿主としました。はじめにPETaseとMHETaseをコードする遺伝子を麹菌に組み込み、酵素生産性を検討しましたが、生産を観察することはできませんでした。I. sakaiensisの遺伝子をそのまま麹菌に導入したところ、予期しないスプライシングやpolyA付加などが起きたため、正常なmRNAが形成されず、結果的に酵素タンパク質が生産されなかったことがわかりました（図1）。
そこで、麹菌で正常なmRNAが形成されるように、遺伝子を工夫したところPETaseとMHETaseは共に生産性が向上しました。遺伝子の工夫とは、I. sakaiensisの言葉を麹菌の言葉に置き換えるようなイメージです。このように改変することにより、生産を確認することができました（図2）。
PETaseとMHETaseをそれぞれ麹菌で生産した。 MHETaseは想定通りの大きさであったが、PETaseは想定より大きかった（青矢印）。
高活性型PET分解酵素の生産検討
麹菌でPETaseとMHETaseを共に生産することができたものの、PETaseについては想定よりも低い酵素活性でした。生産したPETaseが対照と比較して大きかったこと、糖鎖消化処理により対照に近い大きさになったことから、生産されたPETaseには糖鎖が付加されていることがわかりました（図2）。糖鎖が付加されたPETaseは、糖鎖が邪魔をして基質であるPETフィルムに近づきにくくし、その結果みかけの活性が低くなるという「低活性型」PETaseという仮説を立てました（図3）。
酵素タンパク質（だけのもの）は、刃の部分がPETフィルムに密着し切断する（赤矢印）。糖鎖が付加したものは、糖鎖が邪魔をして、PETフィルムに密着しにくくなる（青矢印）。その結果、酵素タンパク質の部分は同じでも、見かけ上「低活性型」になると仮説を立てた。
そこで、糖鎖除去された酵素を生産する工夫をした麹菌育種をするために、Hypocrea jecorina由来endoT遺伝子（糖鎖切断酵素をコードする遺伝子）B)を導入しました。この育種した麹菌では、大幅に糖鎖が減少したPETaseを生産できることがわかりました（図4）。MHETaseとPETaseを含む麹菌培養液でPET樹脂に近いPETフィルム分解活性を評価したところ、「高活性型」は9倍以上の分解活性を示すことが明らかとなりました。
安定で高活性なPET分解酵素「FAST-PETase」の生産検討
近年、機械学習により改良されたPETase（FAST-PETaseと命名）が報告されていますC)。FAST-PETaseは、PETaseと比較して、熱に対する安定性と共に、分解活性などが向上した特長を持っています。そこで、これまで開発してきた「麹菌で正常なmRNAが形成されるように遺伝子を工夫する技術」と「糖鎖除去する麹菌の育種技術」を組み合わせて、FAST-PETaseを生産させました。得られたFAST-PETaseを用いてPETフィルムに作用させたところ、14日目でほぼ分解されることが明らかとなりました（図5）。このFAST-PETaseにより、最も分解しにくいとされるPET樹脂についても部分分解できました。
直径6mmのPETフィルムに精製したFAST-PETaseを作用させた。
今後は培養最適化検討により、FAST-PETaseの生産性を高め、PET樹脂リサイクル実用化に貢献する予定です。
謝辞
本研究で用いたH. jecorina由来endoT遺伝子については、九州大学・樋口裕次郎准教授からご提供頂きました。この場を借りて深く御礼申し上げます。
用語
PETとはpolyethylene terephthalateの略。ポリエステルの一種として知られる。テレフタル酸とエチレングリコールを原料として化学合成される。PETaseは、PETを分解してMHET（methyl-(2-hydroxyethyl) terephthalateの略）などに分解する。MHETaseはMHETをテレフタル酸とエチレングリコールに分解する。
学会発表
- 1）「麹菌Aspergillus oryzaeによるPET分解酵素の異種発現」、○戸所健彦1，伊出健太郎1，南はつね2，河野恵美2，小高敦史1，吉田昭介2，石田博樹1（1月桂冠・総研，2奈良先端大）、2022年度日本農芸化学会大会
- 2）「コドン最適化による、麹菌Aspergillus oryzaeによるIdeonella sakaiensis由来PET分解酵素の異種発現」、○伊出健太郎1，戸所健彦1，佐貫理佳子3，南はつね2，河野恵美2，小高敦史1，吉田昭介2，石田博樹1（1月桂冠・総研，2奈良先端大，3京工繊）、2022年度日本生物工学会大会
- 3）「麹菌Aspergillus oryzaeによる耐熱型PET分解酵素の発現」、○戸所健彦1，伊出健太郎1，佐貫理佳子3，河野恵美2，吉田昭介2，石田博樹1（1月桂冠・総研，2奈良先端大，3京工繊）、2023年度日本生物工学会大会
ニュースリリース
参考文献
- A）Yoshida S. et al., Science (2016), doi: 10.1126/science.aad6359.
- B）Li Q. et al., J Biosci Bioeng (2020), doi: 10.1016/j.jbiosc.2019.12.006.
- C）Lu H. et al., Nature (2022), doi: 10.1038/s41586-022-04599-z.
※所属・肩書・役職等は掲載日のものです。
（掲載日：2024年7月16日）
